Cuối thập niên 1980, chính phủ Xô viết bắt đầu tìm cách thu lợi nhuận từ các vật tư quân sự của mình.

Năm 1989, một công ty cổ phần được Phòng Thiết kế Antonov thành lập với lĩnh vực hoạt động vận chuyển hàng không hạng nặng dưới cái tên "Antonov Airlines", đóng trụ sở tại Kiev, Ukraine và hoạt động từ Sân bay Luton London liên doanh với Air Foyle HeavyLift.[5][6].

Công ty này bắt đầu hoạt động với một phi đội bốn chiếc An-124-100 và ba chiếc Antonov An-12, nhưng tới cuối thập niên 1990 rõ ràng những chiếc An-124 không đáp ứng nổi nhu cầu vận chuyển những hàng hóa lớn hơn nữa. Để đáp ứng nhu cầu này, chiếc An-225 được thay động cơ, chuyển đổi thích hợp cho vận chuyển hàng hóa hạng nặng, và đưa vào sử dụng dưới sự quản lý của Antonov Airlines.

Ngày 23 tháng 5 năm 2001, An-225 nhận được giấy chứng nhận từ Ủy ban Đăng ký Hàng không Liên quốc gia (IAC AR).[7] Chuyến bay thương mại đầu tiên của nó xuất phát từ Stuttgart, Đức ngày 3 tháng 1 năm 2002, bay tới Thumrait, Oman với 216.000 suất ăn chuẩn bị sẵn cho binh sĩ Mỹ đang đóng quân trong vùng. Số lượng suất ăn chuẩn bị sẵn to lớn này được đặt trong 375 pallet và có tổng trọng lượng 187.5 tấn.[8] Từ đó An-225 đã trở thành chiếc máy bay chủ lực trong phi đội của Antonov Airlines, vận chuyển những đồ vật từng được cho là không thể vận chuyển bằng đường không như đầu xe lửa, máy phát điện nặng tới 150 tấn, cũng như trở thành một tài sản giá trị của các tổ chức viện trợ quốc tế vì khả năng vận chuyển to lớn của nó với những loại hàng hóa viện trợ khẩn cấp trong các chiến dịch cứu trợ.[9]

Tới năm 2000, rõ ràng nhu cầu với An-225 đã vượt quá khả năng hoạt động của nó, và vào tháng 9 năm 2006, bộ khung của chiếc An-225 thứ hai đã được dự định tân trang và hoàn thành vào giữa năm 2008[10][11]. Tuy nhiên, thời điểm hoàn thành dự án liên tục bị hoãn lại. Tháng 8 năm 2009, chương trình của máy bay này chính thức ngưng lại dang dở vì lý do thiếu kinh phí.[12][13]

Đầu tháng 6 năm 2003, chiếc An-225 duy nhất, cùng với những chiếc An-124, đã vận chuyển 800 tấn hàng hóa cho các chiến dịch viện trợ nhân đạo tại Iraq.[14] An-225 cũng đã được chính phủ Mỹ ký hợp đồng vận chuyển các thiết bị quân sự tới Trung Đông hỗ trợ cho các lực lượng Liên quân.[9] Việc người Mỹ sử dụng máy bay Liên Xô có thể coi là một minh chứng cho thành công trong lĩnh vực thiết kế máy bay vận tải hạng nặng Xô viết, bởi không một máy bay nào có khả năng tương đương được phát triển tại Hoa Kỳ.